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本试剂盒适用于从各种体液样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。

本试剂盒可以通过简单离心快速高效获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游应用实验。

本试剂盒不适合唾液和乳汁的外泌体提取，需要用于唾液、乳汁外泌体提取请选用高纯度外泌体快速提取试剂盒(乳汁/唾液样品，货号：HR8226)。

• 使用方便，无需超速离心，省时省力；
  
• 纯度高，富集量大，应用范围广；
  
• 获取的Exosome结构和功能完整；
  
• 稳定性好，便于运输，便于保存。

外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性小囊泡，直径约为30～150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各种体液中，研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质、mRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。

外泌体囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，以调节不同范围的生物过程。外泌体囊泡的病理生理作用开始在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中得到充分认识，显现了外泌体作为疾病的早期诊断、治疗干预的潜在新靶点的巨大应用前景。此外，未修饰和工程化的外泌体囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。

传统的体液中分离和提取exosome的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要30～70个小时，每次最多只能处理6个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。

• ?离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
  
• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完！

本试剂盒按每个样本处理4mL体液计，每个50T试剂盒大约可以用于提取200mL体液。如果需要处理大量的体液样本，将提取液按与体液的体积比1：4加入体液样本中即可。

• 正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。
  
• 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
  
• 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
  
• 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
  
• 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
  
• 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

• 以下以4mL体液为例，实际操作时按体液样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。
  
• 不同体液样本的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择体液样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的体液。
  
• 除非已经确认体液样本中含有较多外泌体或者体液样本较难获得，一般体液样本建议每个样体液用量不少于8mL。最好能上样量为15～20mL及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的体液样本。
  
• 条件允许的情况下可以将体液浓缩后再提取外泌体。
  
• 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。
  
• 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
  
  g=r×1.118×10^-5×rpm²
  
  r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米
  例如：转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2（×g）。

• 用缓冲液或纯水进行预清洗。
  
• 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用前移除并稍微离心甩干。
  
  • 可以在外泌体提取步骤中需要使用前再清洗。
    
  • 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。

• 外泌体提取：
  
  • 收集4mL待提取的培养基样品，置2～8℃保存。
    
    • 冻存样品置水浴锅解冻后置2～8℃保存。
  • 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。
    
  • 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。即为4mL待提取体液（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。
• 外泌体纯化：
  
  • 将外泌体纯化离心管C（大）内管插入所提供的一个配套离心管中。
    
  • 向内管中加入过4mL的待提取体液（I）样本，并盖上盖子。
    
    • 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
      
    • 加体液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头（1mL）；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头（200μL）。
  • 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
    
    • 最好使用非固定角度的转子。
      
    • 使用固定角度转子时，将白色膜片面朝上放置。
      
    • 如果使用固定角转子，最好适当减少待提取外泌体悬液体积，可以加至3.5mL。
  • 以4000×g离心约10～15分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
    
    • 离心至大约剩余50μL～100μL液体即可，不要过度浓缩。
      
    • 如果外泌体样本的起始浓度很高，请监控离心过程，以免样本过度浓缩。过度浓缩会导致沉淀，这也可能带来样本损失。第一次做新样品时，可以离心几分钟后观察剩余液体大概体积。
      
    • 建议将滤过液吸入带盖的离心管（自备）中保存，一直保留到外泌体的样品分析测试完成。
      
    • 避免吸头戳破滤膜导致外泌体损失。
      
    • 影响流速的因素包括样本浓度、相对离心力、离心转子的角度以及温度。常见样本的典型离心时间大约是10至20分钟。大部分样本在离心开始后的前5至10分钟发生过滤纯化，但在离心10至20分钟后才能达到最低的纯化液体积（20μL）。
      
    • 可以将浓缩的外泌体用PBS或HEPES等缓冲液（根据下游实验需要选择）稀释，再次离心至大约剩余50μL～100μL，这样的外泌体纯度将再次提高，残余的外源蛋白质和核酸更少。
  • 在50～100μL残余液体中加入2mL外泌体提取液A。
    
  • 以4000×g离心约10～15分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
    
    • 离心至大约剩余50μL～100μL液体即可，不要过度浓缩。
      
    • 如果外泌体样本的起始浓度很高，请监控离心过程，以免样本过度浓缩。过度浓缩会导致沉淀，这也可能带来样本损失。第一次做新样品时，可以离心几分钟后观察剩余液体大概体积。
      
    • 建议将滤过液吸入带盖的离心管（自备）中保存，一直保留到外泌体的样品分析测试完成。
      
    • 避免吸头戳破滤膜导致外泌体损失。
  • 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
    
    • 外泌体可能会有少量的吸附损失，吸附损失取决于外泌体浓度、与过滤纯化内管表面接触的温度和时间。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收过滤后的外泌体样本。
  • 为了回收纯化后的外泌体，用200μL移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50～100μL纯化外泌体悬液（II）。
    
    • 要达到理想的回收效果，请尽快吸出纯化外泌体悬液。
      
    • 从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
      
    • 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
      
    • 注意确保外泌体悬液完全吸出。
  • 套上外泌体纯化离心管D（小）的液体收集管，将纯化外泌体悬液（II）吸入外泌体纯化离心管D（小）的离心管（内管）中，加入50μL外泌体提取液B，在4℃，11000～13000×g条件下离心10～15分钟。
    
    • 外泌体纯化离心管D（小）重复利用，一般一个离心管可以用5～10次。
      
    • 外泌体纯化离心管D（小）内管对外泌体没有吸附，离心后可以直接重复使用。
      
    • 如果需要清洗离心管，可以加入PBS用移液器吹打，吸掉PBS。再次加入新的PBS，在10000×g离心10分钟即可。
  • 吸取外泌体纯化离心管D（小）的收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
    
    • 可以根据下游实验需要，用相应的缓冲液稀释保存外泌体。
      
    • 也可以用试剂盒中配的外泌体提取液B稀释保存外泌体。
      
    • 也可直接用于外泌体蛋白提取。
      
    • 将外泌体样本-80℃保存或直接用于下游应用。
      
    • 外泌体短期保存可以置于2～8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。
      
    • 保存前可以用0.22μm或0.35μm滤器过滤除菌。
  • 用纯水或缓冲液洗涤两种大小的内管和收集管，继续纯化下一个样品。
    
    • 洗涤内管时，加入400μL PBS缓冲液或其它缓冲液，用吸头反复吹打，吸掉缓冲液即可。
      
    • 用PBS洗涤3～4次。
      
    • 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
      
    • 每个离心管内管建议重复使用5次，不要超过10次。
      
    • 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
      
    • 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。

• 使用后用水冲洗干净；
  
• 内管加入超纯水4mL，4000g离心5分钟；
  
• 吸净内管中的水，加入4mL 0.1M NaOH，4000×g离心20分钟；
  
• 用0.1M NaOH浸泡24小时；
  
• 用水冲洗干净；
  
• 用无菌水浸泡2～8℃保存。
  
• 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。
  • 1个月不用的话，直接用100mM的NaOH保存！更长时间的话加0.02%的叠氮钠。
    
  • 再次使用前，用纯水充分冲洗干净，然后根据下游实验需要，用相应的缓冲液平衡。

• 准备做外泌体siRNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少？
  普通体液建议使用40mL以上的初始样品量。由于体液中外泌体含量比较低，建议先将上清浓缩，准备40mL以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。
  
• 如何鉴定提取的外泌体？
  通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。
  
• 外泌体WB标志蛋白用什么？
  在进行WB检测时，通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101、ALIX、HSP70等。
  
• 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
  没有，该检测属于定性检测。
  
• 蛋白浓度低？
  很多外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大体液的上样量。
  处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
  
• 抽提得到的RNA浓度低？
  很多外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大体液的上样量。
  
• 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
  不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10～20μL。
  
• 可以重复使用过滤管么？
  可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。
  
• 外泌体在纯化时出现了沉淀，如何改进？
  如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的外泌体浓度很高，建议降低最终的外泌体浓度，保留更多的液体。
  对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：
  
  • 离心力降低30%～50%
    
  • 在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。
• 有时候用外泌体纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
  如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。
  
• 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到外泌体的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
  可以，但是低温可能会增加外泌体样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。